PENDAHULUAN
Pembentukan ikan mas
tahan Koi Herpes Virus (KHV) dengan transgenesis merupakan salah satu upaya
untuk menanggulangi berkembangnya virus KHV pada ikan mas. Teknologi
transgenesis memungkinkan untuk membentuk produk perikanan dengan karakteristik
yang diinginkan seperti ikan mas yang tahan KHV. Rekayasa genetik dengan
transgenesis dapat digunakan untuk mentransfer gen asing dalam hal ini gen
imonogenik tahan KHV pada individu ikan mas secara in vitro, sehingga
diharapkan akan menghasilkan ikan mas transgenik yang tahan KHV.
Beberapa teknik yang
dapat digunakan untuk transfer gen antara lain mikroinjeksi, elektroporasi,
biolistik viral vector, dan lipofeksi (Beaumont & Hoare, 2003). Teknik yang
biasa digunakan untuk transfer gen pada ikan adalah mikroinjeksi (Ozato et al.,
1986; Zhang et al., 1990); inkubasi sperma (Khoo et al., 1992); elektoporasi
sperma (Walker et al., 1995); dan telur (Powers et al., 1992). Salah satu
teknik transfer gen yang banyak digunakan pada ikan saat ini adalah
elektroporasi, karena selain mudah teknik ini juga dapat menghasilkan atau
memproduksi ikan transgenik secara massal.
Transfer gen pada ikan
dengan metode elektroporasi dapat dilakukan pada sperma atau telur.
Elektroporasi memanfaatkan serangkaian kejutan listrik pendek untuk memodifikasi
membran sel dan memberi peluang pada transgen untuk masuk ke dalam sel
(Beaumont & Hoare, 2003; Sarmasik, 2003). Pada elektroporasi sperma, gen
diintroduksikan pada sperma dan digunakan untuk membuahi sel telur. Sperma
berperan sebagai pembawa DNA eksogen untuk ditransfer ke dalam genom ikan
melalui pembuahan dengan sel telur. Sel sperma telah digunakan sebagai vektor
untuk transfer gen pada telur ikan zebra (Khoo et al., 1992); ikan medaka
(Ozato et al., 1992); ikan salmon (Sin et al., 1993); dan ikan patin siam (Dewi
et al., 2010).
Keberhasilan transfer
gen pada ikan salmon (Sin et al., 1993; Symonds et al., 1994) dan ikan patin
siam (Dewi, 2010) dengan sperma yang dielektroporasi bergantung pada kuat medan
listrik, panjang kejutan, dan konsentrasi DNA yang diberikan. Tingkat
keberhasilan transfer gen yang tinggi pada ikan salmon diperoleh dengan
pemberian konsentrasi DNA (pRSV-lacZ) yang tinggi (100 μg/mL) (Symonds et al.,
1994), sedangkan keberhasilan transfer gen PhGH eksogen pada ikan patin siam
yang diintroduksi dengan konsentrasi 10 μg/mL, 50 μg/mL, dan 90 μg/mL, secara
berturut-turut adalah 28,57%; 78,57%; dan 85,71% (Dewi, 2010) . Berdasarkan
beberapa hasil penelitian tersebut, pada penelitian ini dilakukan transfer gen
imunogenik tahan KHV (krt-GP11) pada ikan mas (Cyprinus carpio) dengan konsentrasi berbeda. Penelitian ini
bertujuan untuk mengetahui konsentrasi DNA optimal yang efektif digunakan dalam
transfer gen pada ikan mas.
BAHAN DAN METODE
Konstruksi Gen dan
Isolasi Plasmid
Gambar 1. Konstruksi
pkrt-GP11 (7,1 kb). Sumber: Alimuddin, 2009; belum dipublikasikan
Figure 1. Construction of pkrt-GP11 (7.1 kb).
Source: Alimuddin, 2009; unpublish
Konstruksi gen
(plasmid) yang digunakan adalah pkrt-GP11 yang tersusun dari promoter keratin ikan
sebelah (Japanese flounder Paralichthys olivaceus) dan gen glikoprotein 11 (GP11), panjang total konstruksi 7,1 kb
(Gambar 1) (Alimuddin, 2009; belum dipublikasikan). DNA plasmid diisolasi
dengan GeneJET plasmid DNA Purification Kit (Thermo Scientific) dan konsentrasi
DNA plasmid diukur dengan GeneQuantTM1300.
Koleksi Sperma dan
Telur
Sperma dan telur
dihasilkan dari masingmasing satu ekor induk ikan mas jantan yang berukuran 2
kg dan betina berukuran 4 kg berasal dari Balai Penelitian Pemuliaan Ikan,
Sukamandi. Induk yang telah matang gonad dipilih untuk dipijahkan dan
ditempatkan ke dalam bak pemijahan. Induk diinduksi dengan penyuntikan hormon
perangsang pemijahan ( ovaprim) untuk mendapatkan keseragaman kematangan
sperma, telur, dan waktu ovulasi. Pada induk betina, hormon perangsang
pemijahan diberikan dengan dosis 0,3 mL/kg bobot; sedangkan pada induk jantan
diberikan dengan dosis 0,15 mL/kg bobot. Sel telur dan sperma diperoleh dengan
cara stripping yang dilakukan 10-12 jam setelah penyuntikan.
Elektroporasi Sperma
Transfer gen pada
sperma ikan mas dilakukan dengan elektroporasi menggunakan mesin Gene Pulser II
(Biorad, USA). Sperma diencerkan dengan menggunakan larutan fisiologis NaCl
0,85% (1:1) sebelum dicampur dengan konstruksi gen. Elektroporasi dilakukan
dengan tipe kejutan square wave dengan panjang kejutan 30 milidetik; interval
kejutan 0,1 detik; voltase 50; dan jumlah kejutan tiga kali. Konsentrasi DNA
eksogen yang digunakan adalah 10 μg/mL, 50 μg/mL, dan 100 μg/mL dalam buffer TE
(Tris-EDTA). Kondisi elektroporasi ini mengacu pada metode elektroporasi pada
sperma ikan patin (Dewi et al., 2010) dan pada sperma ikan mas (Syahputra et
al., 2011). Pengamatan Motilitas
Motilitas sperma hasil
elektroporasi diamati dengan mikroskop perbesaran 10x40. Satu
Tabel 1. Kriteria penilaian motilitas sperma
Table 1. Criteria of sperm motility
tetes sperma diteteskan
di atas gelas objek kemudian ditutup dengan gelas penutup. Sperma diaktivasi
dengan meneteskan aquadest pada tepi gelas penutup. Penilaian pergerakan atau
motilitas spermatozoa didasarkan pada kriteria banyaknya sperma yang bergerak
maju (progresif) (Tabel 1).
Ekstraksi DNA Genom
pada Sperma, Embrio, dan Larva
Untuk mengetahui
keberhasilan transfer gen, dilakukan deteksi transgen pada genom sperma,
embrio, dan larva dengan metode PCR. Sebelum dilakukan ekstraksi DNA genom
sperma, sperma yang telah dielektroporasi dicuci dengan larutan fisiologis dan
diberi perlakuan DNase I. Sebanyak 30 μL sperma dicuci menggunakan larutan NaCl
0,85% dengan cara diresuspensi dan disentrifugasi dengan kecepatan 3.000 rpm.
Pencucian dilakukan sebanyak dua kali. Sperma yang telah dicuci diberi
perlakuan 1 μL DNase I (Thermo Scientific) untuk setiap 30 μL sperma. Setelah
diberi perlakuan DNase I, sperma dicuci kembali dengan larutan NaCl 0,85% dan
kemudian dilakukan ekstraksi DNA genom. DNA genom dari sperma, embrio, dan
larva diekstraksi menggunakan GeneJET Genomic DNA Purification Kit (Thermo
Scientific).
Amplifikasi Gen GP11
dengan Polymerase Chain Reaction (PCR)
Kriteria (Criteria ) Skor (Score)
> 70% sperma
bergerak maju (Sperm move forward) (Progressive) 5
55%-70% sperma bergerak
maju (Sperm move forward) (Progressive) 4
40%-55% sperma bergerak
maju (Sperm move forward) (Progressive) 3
25%-40% sperma bergerak
maju (Sperm move forward) (Progressive) 2
10%-25% sperma bergerak
maju (Sperm move forward) (Progressive) 1
1%-10% sperma bergerak
maju (Sperm move forward) (Progressive) 0.5
Semua sperma tidak
bergerak (All sperms not move) (Non-motile) 0
Sumber (Source): Dewi
et al. (2010)
Sebanyak 2 μL DNA genom
diamplifikasi dengan menggunakan kit PCR Maxima Hot Start Green PCR Master Mix
(Thermo Scientific). Primer yang digunakan untuk amplifikasi gen GP11 adalah
F81: 5’-TTA CCG GTA TGG CCT CCA CTT CAA CCG CT-3’ dan R81: 5’-TTA AGC GAG CAG
TCC CCT CGG GTT CTT-3’
dengan panjang fragmen
1.481 bp. Proses PCR dilakukan dengan program: 95oC selama empat menit; (95oC
selama 30 detik; 64oC selama 30 detik; 72oC selama satu menit) sebanyak 40
siklus; dan 72oC selama sepuluh menit. Hasil amplifikasi PCR dicek dengan
elektroforesis pada gel agarose 1,5%. Sebagai kontrol internal digunakan gen
β-aktin ikan mas dengan panjang fragmen 300 bp, primer yang digunakan adalah F:
5’-CCCTGGCCCCCAGCACAA TG-3’ dan R: 5’-TCTGCGCAGTTGAGTCGG CG-3’.
Isolasi RNA total,
Sintesis cDNA dan Reverse Transcriptase PCR
RNA total diekstraksi
dari embrio dan larva menggunakan TRI Reagent® (Molecular Research Center,
Inc.). Kualitas dan kemurnian RNA diukur dengan spektrofotometer GeneQuantTM1300
(GE) pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Sebanyak 100 ng-5 μg RNA total
digunakan untuk mensintesis cDNA menggunakan kit Ready-To-Go You-Prime
FirstStrand Beads (GE Healthcare) dengan menambahkan oligo (dT) (Roche,
Germany) sebagai primer. cDNA diamplifikasi dengan PCR menggunakan primer
spesifik untuk gen GP11 dan β-aktin, gen β-aktin digunakan sebagai kontrol
jumlah dan kualitas dari cDNA. Produk PCR dielektroforesis pada gel agarose
1,5%.
HASIL DAN BAHASAN
Motilitas, Pembuahan,
dan Penetasan
Indeks motilitas sperma
ikan mas pada masing-masing perlakuan disajikan pada Tabel 2.
Peningkatan konsentrasi
DNA yang diberikan pada kegiatan elektroporasi tidak memengaruhi secara
signifikan terhadap motilitas dari sperma, meskipun terdapat sedikit penurunan
motilitas sperma pada perlakuan dengan konsentrasi DNA 100 μg/mL. Pemberian
konsentrasi DNA 10 μg/mL dan 50 μg/ mL menghasilkan motilitas sperma terbaik
dan relatif sama dengan kontrol (Tabel 2). Motilitas sperma yang baik tentunya
akan meningkatkan kemampuan sperma dalam membuahi telur dan sebaliknya
motilitas sperma yang kurang baik akan menurunkan kemampuan sperma dalam
membuahi telur. Motilitas sperma sangat krusial dan penting saat sperma
melakukan penetrasi pada membran sel telur dalam proses pembuahan (Ginsburg,
1963).
Penurunan motilitas
sperma pada proses elektroporasi lebih disebabkan oleh kuat kejutan listrik
(voltase) yang diberikan (Sin et al., 1993; Dewi et al., 2010; Syahputra et
al., 2011). Elektroporasi yang dilakukan dengan voltase 50 dengan jumlah
kejutan tiga kali memberikan persentase motilitas sperma yang tidak jauh
berbeda dengan penelitian sebelumnya (Syahputra et al., 2011), motilitas sperma
yang teramati tidak berbeda dengan kontrol.
Selanjutnya sperma yang
telah dielektroporasi tesebut digunakan untuk membuahi telur ikan mas yang
sudah disiapkan. Hasil fertilisasi telur menggunakan sperma yang
dielektroporasi disajikan pada Gambar 2.
Sperma yang
dielektroporasi dengan pemberian konsentrasi DNA yang berbeda memiliki
kemampuan yang sama untuk membuahi sel telur (Gambar 2). Persentase derajat
pembuahan dan laju perkembangan embrio yang teramati relatif sama jika
dibandingkan dengan sperma yang tidak diberi perlakuan atau kontrol, persentase
derajat pembuahan yang
Tabel 2. Pengaruh konsentrasi
DNA terhadap motilitas sperma yang dielektroporasi
Table 2. Effect of DNA
concentration on the motility of electroporated sperm
Konsentrasi DNA
Skor motilitas DNA
concentration
Motility score (μg/mL)
Kontrol (Control) 4
10 4
50 4
100 3
teramati pada
penelitian ini juga tidak berbeda dengan penelitian sebelumnya (Syahputra et
al., 2011). Derajat pembuahan telur ikan mas pada penelitian ini lebih
dipengaruhi oleh perlakuan elektroporasi pada sperma yang digunakan dan faktor
biologis seperti kualitas sperma dan telur yang digunakan. Kejutan
listrik pada
elektroporasi sperma memengaruhi proses fertilisasi telur (Cheng et al., 2002).
Evaluasi derajat
penetasan telur yang dibuahi dengan sperma yang dielektroporasi disajikan pada
Gambar 3.
DNA concentration
(μg/mL)
Gambar 2. Derajat
pembuahan (%) telur ikan mas yang dibuahi oleh sperma yang dielektroporasi. Bar
merupakan standar deviasi (n = 3)
Figure 2. Fertilization
rate (%) of egg fertilized by electroporated sperm.
Bars are standard
deviation (n = 3)
DNA concentration
(μg/mL)
Gambar 3. Derajat
penetasan (%) telur ikan mas yang dibuahi oleh sperma yang dielektroporasi. Bar
merupakan standar deviasi (n = 3)
Figure 3. Hatching rate
of embryo fertilised by electroporated sperm.
Bars are standard
deviation (n = 3)
Derajat penetasan telur
juga menunjukkan hasil yang sama dengan derajat pembuahan, pemberian
konsentrasi DNA berbeda pada perlakuan elektroporasi menghasilkan derajat dan
waktu penetasan yang tidak berbeda signifikan dibandingkan dengan kontrol,
meskipun terjadi penurunan seiring peningkatan konsentrasi DNA yang diberikan
(Gambar 3). Konsentrasi DNA yang diberikan pada elektroporasi sperma
memengaruhi terhadap derajat penetasan (Tsai, 2000). Elektroporasi dengan
pemberian DNA dengan konsentrasi 10 μg/mL menghasilkan persentase derajat
penetasan terbaik (45%) dibandingkan dengan perlakuan konsentrasi DNA lainnya,
sedangkan waktu penetasan terjadi setelah 42 jam dan tidak terdapat perbedaan
antara perlakuan dengan kontrol. Derajat penetasan yang lebih tinggi tentunya
akan meningkatkan peluang untuk menghasilkan atau memproduksi ikan mas
transgenik.
Persentase derajat
penetasan telur pada kegiatan elektroporasi dipengaruhi beberapa faktor
seperti; kejutan listrik, kualitas sperma, kualitas telur, dan kelangsungan
hidup (sintasan) dari embrio. Kualitas telur yang digunakan dalam pemijahan
buatan pada kegiatan elektroporasi menentukan sintasan embrio, dan derajat
penetasan (Cheng et al., 2002). Sintasan embrio yang rendah merupakan efek dari
penurunan viabilitas dan kemampuan fertilitas dari sperma yang dielektroporasi
(Sin et al., 1993; Xie et al., 1993).
Deteksi Gen GP11 pada
Sperma, Embrio, dan Telur
Hasil deteksi gen
krt-GP11 yang ditransfer pada sperma yang dielektroporasi, embrio, dan larva
ikan mas disajikan pada Gambar 4.
Pada sperma, gen
krt-GP11 terdeteksi pada semua perlakuan level konsentrasi DNA yang digunakan.
Begitu juga pada embrio dan larva hasil pembuahan dari sperma yang
dielektroporasi, gen krt-GP11 dapat terdeteksi pada setiap perlakuan yang
diberikan. Hasil pengamatan menunjukkan bahwa sperma ikan mas dapat digunakan
sebagai vektor untuk mentransfer gen yang diinginkan (krt-GP11) pada embrio dan
larva melalui pembuahan pada sel telur. Sel sperma juga telah dilaporkan dapat
digunakan sebagai vektor untuk transfer gen pada ikan zebra (Khoo et al.,
1992); ikan medaka (Ozato et al., 1992); ikan salmon (Sin et al., 1993); ikan
loach (Tsai et al., 1995),; ikan ayu (Cheng et al., 2002); dan ikan patin siam (Dewi
et al., 2010).
Hasil deteksi gen
krt-GP11 pada embrio dan larva menunjukkan bahwa peningkatan level konsentrasi
DNA yang diberikan tidak memberikan hasil yang berbeda terhadap keberhasilan
transfer gen pada embrio dan larva ikan mas. Pada elektroporasi sperma,
efisiensi transfer gen yang terbaik dapat dicapai dengan pemberian konsentrasi
DNA yang kecil menggunakan kejutan listrik yang tinggi (Sin et al., 1993).
Ekspresi Gen GP11 pada
Embrio dan Larva
Analisis ekspresi gen
GP11 dilakukan pada embrio dan larva yang positif membawa gen krt-GP11.
Ekspresi gen GP11 pada embrio dan larva ikan mas dari setiap perlakuan level
konsentrasi DNA disajikan pada Gambar 5 dan 6.
Hasil analisis ini
menunjukkan bahwa promoter keratin ikan sebelah (Japanese flounder Paralichthys
olivaceus) dapat mengendalikan ekspresi
gen GP11 pada embrio ikan mas. Selain dapat diintroduksi ke dalam embrio ikan
mas, gen GP11 juga dapat diekspresikan dengan baik. Transgen dapat
diekspresikan sangat bergantung pada pemilihan elemen regulator (promoter) yang
tepat (Sheela et al., 1998). Konstruksi gen yang membawa promoter fungsional
dapat mengekspresikan transgen pada sejumlah individu transgenik (
Sarmasik, 2003).
M (+) (-) 10 50 100 M (+) (-)
10 50 100 M (+) 10 50
100
Gambar 4. Deteksi gen
krt-GP11 pada sperma yang dielektroporasi (A), embrio (B), dan larva (C). M
adalah marker DNA (VC 100 bp Plus DNA Ladder, Vivantis) dan angka 10, 50, 100
menunjukkan konsentrasi DNA (μg/mL). Panjang fragmen gen krt-GP11 1.481 bp
Figure 4. Detection of krt-GP11 in
electroporated sperm (A), embryo (B), and larvae (C). M = DNA Marker ladder (VC
100 bp Plus DNA Ladder, Vivantis) and 10, 50, 100 = DNA
concentration (μg/mL).
Amplified product of krt-GP11 is 1,481 bp
M (+) (-) 10 50
100 M 10 50 100
Gambar 5. Deteksi ekspresi gen GP11 (A) dan β- aktin
(B) pada embrio hasil pembuahan dari sperma
yang dielektroporasi. M adalah marker DNA (VC 100 bp Plus
DNA Ladder, Vivantis), tanda (+) merupakan kontrol positif PCR, tanda (-)
merupakan kontrol negatif PCR dan angka 10, 50, 100 menunjukkan konsentrasi DNA
(μg/mL). Panjang fragmen gen krt-
GP11 1.481 bp dan β-
aktin 240 bp
Figure 5. Detection of krt-GP11 (A) nd β- actin
(B) expression in embryos fertilised by electroporated sperm. M = DNA Marker
ladder (VC 100 bp Plus DNA Ladder, Vivantis), (+) = positive control, (-) = negative control and
10, 50, 100 = DNA concentrations
(μg/mL). Amplified
products of krt-GP11 (1,481 bp) and β- actin (240 bp), respectively
M (+) (-) 10 50
100 M 10 50 100
Gambar 6. Deteksi ekspresi gen GP11 (A) dan β- aktin
(B) pada larva. M adalah marker DNA (VC
100 bp Plus DNA Ladder, Vivantis), tanda (+) merupakan kontrol positif
PCR, tanda (-) merupakan kontrol negatif PCR dan angka 10, 50, 100 menunjukkan
konsentrasi DNA (μg/mL). Panjang fragmen gen krt-GP11 1.481 bp dan β- aktin 240
bp
Figure 6. Detection of krt-GP11 (A) and β- actin (B)
expression in larvae. M = DNA Marker ladder ( VC 100 bp Plus DNA Ladder,
Vivantis), (+) = positive control, (-) = negative control and 10, 50, 100 = DNA
concentrations (μg/mL). Amplified products of krt-GP11 (1,481 bp) and β- actin
(240 bp), respectively
Berbeda dengan embrio,
ekspresi gen periksa tidak positif membawa gen GP11. GP11 tidak terdeteksi pada
larva dari setiap Perlu dilakukan penelitian lanjutan untuk perlakuan (Gambar
6). Tidak terdeteksinya mendetekasi ekspresi pada benih yang positif ekspresi
gen GP11 pada larva dapat dise- membawa gen GP11 secara individu. Selain babkan
karena kemungkinan larva yang di- itu, juga dapat disebabkan karena gen GP11
yang diintroduksikan
tidak diekspresikan atau level ekspresinya rendah pada fase larva. Seperti yang
dilaporkan oleh Dewi (2010), ekspresi gen EGFP yang diintroduksikan pada ikan
patin siam menurun pada jam ke-30 yaitu pada fase larva. Pola ekspresi gen GP11
pada ikan mas perlu diteliti lebih lanjut pada setiap fase perkembangan ikan
mas.
Keberhasilan transfer
gen pada penelitian ini membuka peluang untuk menghasilkan ikan mas transgenik
founder tahan KHV, meskipun masih diperlukan penelitian lanjutan mengenai pola
dan kestabilan ekspresi gen GP11 pada tiap fase perkembangan ikan mas. Ikan mas
transgenik founder yang berhasil dibentuk akan dibesarkan dan dilakukan deteksi
transgen pada gamet. Ikan mas transgenik founder yang positif membawa transgen
pada gamet digunakan untuk memproduksi ikan mas transgenik tahan KHV generasi
selanjutnya.
KESIMPULAN
Konsentrasi DNA 10
μg/mL efektif digunakan dalam transfer gen krt-GP11 pada ikan mas menggunakan
metode elektroporasi. Elektroporasi sperma dengan pemberian konsentrasi DNA 10
μg/mL selain memberikan tingkat keberhasilan transfer gen yang tinggi juga
menghasilkan persentase derajat pembuahan dan penetasan yang lebih baik
dibandingkan dengan perlakuan level konsentrasi DNA yang lain. Ekspresi gen
krt-GP11 yang berhasil diintroduksikan pada ikan mas baru dapat teramati dengan
baik pada fase embrio.
Hasil karya ilmiah dan
telah di publikasikan
Khairul Syahputra,
Didik Ariyanto, Erma Primanita Hayuningtyas, dan Lamanto
Balai Penelitian
Pemuliaan Ikan
Jl. Raya 2 Sukamandi,
Subang 41263
E-mail:
khairul_syahputra@yahoo.com
DAFTAR ACUAN
Beaumont, A.R. &
Hoare, K. 2003. Biotechnology and genetics in fisheries and aquaculture. School
of Ocean Sciences University of Wales, Bangor, UK. Blackwell Scienc., 158 pp.
Cheng, C.A., Liu, K.L.,
Lau, E.L., Yang, T.Y., Lee, C.Y., Wu, J.L., & Chang, C.Y. 2002. Growth
promotion in ayu (Plecoglossus altivelis) by gene transfer of the rainbow trout
growth hormone gene. Zoological Studies, 41(3): 303-310.
Dewi, R.R.S.P.S.,
Alimuddin, Sudrajat, A.O., Sumantadinata, K., & Sularto. 2010. Optimal
electroporation condition for sperm mediated gene transfer in stripped catfish
(Pangasinodon hypophthalmus). Indonesian Aqualculture Journal, 5( 5): 1-10.
Dewi, R.R.S.P.S. 2010.
Studi over-ekspresi gen penyandi hormon pertumbuhan melalui elektroporasi
sperma untuk membuat ikan patin siam transgenik cepat tumbuh.
Disertasi (tidak
dipublikasi).
Ginsburg, A.S. 1963.
Sperm-egg association and its relationship to the activation of the egg in
salmonid fishes. J. Embryol. Exp. Morp., 11: 13-33.
Khoo, H.W., Ang, L.H.,
Lim, H.B., & Wong, K.Y. 1992. Sperms cells as vectors for introducing
foreign DNA into zebrafish. Aquaculture, 107: 1-19.
Ozato, K., Kondoh, H.,
Inohara, H., Iwamatsu, T., Wakamatsu, Y., & Okada, T.S. 1986. Production of
transgenic fish: introduction and expression of chicken-ä crystalin gene in
medaka embryos. Cell. Differ., 19: 237-244.
Ozato, K., Wakamatsu,
Y., & Inoue, K. 1992. Medaka as model of transgenic fish. Molecular Marine
Biology and Biotechnology, 1: 346-354.
Powers, D.A., Hereford,
L., Cole, T., Chen, T.T., Lin, C.M., Knight, K., Creech, K., & Dunham, R.
1992. Electroporation: A method for transfering genes into the gametes of zebrafish
(Brachydanio rerio), chanel catfish (Ictalurus punctatus) and common carp (Cyprinus carpio). Mol. Mar.
Biol. Biotechnol., 1: 301-308.
Sarmasik, A. 2003.
Application of gene transfer technology for genetic improvement of fish. Turk.
J. Zool., 27: 1-6.
Sheela, S.G., Chen,
J.D., Mathavan, S., & Pandian, T.J. 1998. Construction, electroporatic
transfer and expression of ZpβypGH and ZpβrtGH in zebrafish. J. Biosci., 23:
565576.
Sin, F.Y.T., Bartlet,
A.L., Walker, S.P., Sin, I.L., Symonds, J.E., Hawke, L., & Hopkins, C.L.
1993 . Gene transfer in chinook salmon (Oncorhyncus tshawytscha) by
electroporating sperm in the presence of pRSV-lacZ DNA. Aquaculture, 117:
57-69.
Syahputra, K., Dewi,
R.R.S.P.S., Ariyanto, D., & Hayuningytas, E.P. 2011. Optimasi kondisi
elektroporasi untuk transfer gen pada sperma ikan mas (Cyprinus Carpio).
Prosiding Teknologi Akuakultur Indonesia
(FITA), Bali.
Symonds, J.E., Walker,
S.P., & Sin, F.Y.T. 1994. Electroporation of salmon sperm with plasmid DNA:
Evidence of enhanced sperm/ DNA association. Aquaculture, 119: 313327.
Tsai, H.J. 2000.
Electroporated sperm mediation of a gene transfer system for finfish
and shelfish. Molecular
Reproduction and Development, 56: 281-284.
Tsai, H.J., Tseng,
F.S., & Liao, I.C. 1995. Electroporation of sperm to introduce foreign DNA
into the genome of loach (Misgurnus anguillicaudatus). Can. J. Fish Aquat Sci.,
52: 776-787.
Walker, S.T., Symonds,
J.E., Sin, I.L., & Sin, F.Y.T. 1995. Gene transfer by electroporated
chinnok salmon sperm. J. Mar. Biotechnol., 3: 232-234.
Xie, Y., Liu, D., Zou,
J., Li, G., & Zhu, Z. 1993. Gene transfer via electroporation in fish.
Aquaculture, 111: 207-213.
Zhang, P., Hayat, M.,
Joyce, C., GonzalezVillasenor, L.I., Lin, C.M., Dunham, R.A., Chen, T.T., &
Powers, D.A. 1990. Gene transfer, expression and inheritance of pRSVrainbow
trouth-GH cDNA in the common carp, Cyprinus carpio (Linnaeus). Mol. Reprod.
Dev., 25: 3-13.
0 comments:
Post a Comment